DALINTIS | SPAUSDINTI | SIŲSTI EL. PAŠTU
Noriu pradėti priminimu, kuris viešose diskusijose dažnai pasimeta: Covid mRNR vakcinos yra išties nauji medicinos produktai.
Iki 2020 m., kai buvo išduoti skubūs leidimai, mRNR vakcinos technologija niekada nebuvo plačiai taikoma žmonėms. Ši platforma buvo išbandyta su žmonėmis tik dviejuose klinikiniuose tyrimuose, viename – „Pfizer-BioNTech“ ir kitame – „Moderna“. Iš viso medicinos istorijoje mRNR vakciną yra gavę maždaug 37 000 žmonių (neįskaitant ankstesnės patirties su pasiutligės, CMV ir vėžio vakcinomis, apsiribojusios daug mažesniais ankstyvosios fazės tyrimais). Tai ne kritika, o tiesiog fakto konstatavimas. Tačiau tai reiškia, kad šių produktų ilgalaikis saugumo profilis buvo ir tebėra nevisiškai suprantamas.
Toliau pateikta informacija yra žinoma beveik visiems molekulinės biologijos specialistams. Tai sudėtinga, bet, atsižvelgdamas į tai, kiek daug pastangų skiriate, stengiuosi tai supaprastinti. Svarbu visiems aiškiai išdėstyti molekulinę struktūrą, nes tai, kaip šios vakcinos gaminamos, tiesiogiai lemia, kas yra buteliuko viduje.. O tai, kas yra buteliuko viduje, sušvirkšta, pasklis po visą kūną ir suaktyvins įvykių kaskadą, galinčią sukelti ilgalaikių pasekmių sveikatai.
In vitro transkripcija yra ne tik gamybos detalė
Modifikuotos mRNR vakcinos gaminamos naudojant procesą, vadinamą in vitro transkripcija (IVT)IVT yra metodas, naudojamas modifikuotai mRNR, kuri galiausiai tampa veikliąja vakcinos medžiaga, sintezei.
Tai nėra trivialus techninis niuansas. IVT iš esmės formuoja galutinio produkto molekulinę sudėtį.
„BioNTech“ mokslininkai, įskaitant tuos, kurie tiesiogiai dalyvavo kuriant „Pfizer“ vakciną, paskelbė išsamią apžvalgą.1 aprašoma, kaip IVT reakcijos sukuria ne tik numatytą viso ilgio mRNR, bet ir įvairius šalutinius produktus bei priemaišas, kaip jie paprastai pašalinami ir kokios gali būti jų biologinės pasekmės, jei jie išlieka. Šias gamybos kryptis kartu su jų sukuriamais šalutiniais produktais taip pat išsamiai aprašė „Moderna“ savo patentuose (US10 653 712 B2 ir US10 077 439 B2). Tačiau dar svarbiau, kad ši molekulinė biologija buvo gerai žinoma dar gerokai prieš Covid. Visa tai nėra spekuliatyvu.
Pradinė medžiaga: DNR šablonai
Iš esmės IVT reakcija prasideda nuo dvigrandės DNR, kuri koduoja norimą baltymą. Šiuo atveju – SARS-CoV-2 smaigalio baltymą.
mRNR vakcinose naudojama smaigalį koduojanti seka yra genetiškai modifikuotas siekiant pagerinti stabilumą ir ląstelių toleranciją, įskaitant du aminorūgščių pakeitimus, kurie jį skiria nuo virusinio smaigalio. Ši modifikacija yra tyčinis.
Pats DNR šablonas gali būti įvairių formų. Ankstyvųjų „Pfizer“ klinikinių tyrimų metu buvo naudojami PGR gauti DNR fragmentai. Tačiau komercinis gamybos procesas rėmėsi iš plazmidžių gauta DNR. Tai svarbu, nes plazmidėse yra papildomų reguliavimo sekų. „Pfizer“ atveju tai apima tokius elementus kaip SV40 promotorius ir ori sekos, kurios kelia susirūpinimą, jei patektų į žmogaus ląsteles.
Kai šis DNR šablonas pridedamas prie IVT reakcijos kartu su RNR polimeraze ir kitais komponentais, jis transkribuojamas į mRNR (1 pav.).
IVT gamina šalutinius produktus pagal dizainą
Nors pageidaujamas IVT rezultatas yra numatytas viso ilgio mRNR produktas, tikrasis rezultatas yra sudėtingesnis. Tai apima įvairius šalutinius produktus, tokius kaip (1) įvairios RNR rūšys, įskaitant dvigrandes RNR (dsRNR), (2) prie RNR prijungta DNR (RNR-DNR hibridai) ir (3) laisva DNR iš pradinio šablono (2 pav.).
Šių šalutinių produktų susidarymas yra gerai dokumentuotas ir neišvengiamas, todėl tolesnis valymas yra absoliučiai būtinas saugumui užtikrinti.
2 pav. IVT gamybos šalutiniai produktai ir teršalai. Paveikslėlis adaptuotas iš 1.
Valymas turi žinomų apribojimų
Po pagaminimo reikia atlikti du gryninimo etapus: pirmiausia pašalinti DNR, o po to – RNR šalutinius produktus (3 pav.):
3 pav. IVT šalutinių produktų pašalinimas. Paveikslėlis adaptuotas iš 2.
DNR pašalinimui į reakcijos mišinį pridedamas fermentas, vadinamas DNazė I, kuris dažniausiai naudojamas užteršiančiai DNR skaidyti. Nors DNazė I veiksminga prieš laisvą šabloninę DNR, daugybė tyrimų, įskaitant pačių „BioNTech“ mokslininkų atliktus darbus, rodo, kad DNazė I neefektyviai pašalina prie RNR prijungtą DNR (RNR-DNR hibridus).
Šis apribojimas nėra ginčytinas. Jis aprašytas literatūroje.
Ką parodė nepriklausomos analizės
Šis kontekstas yra labai svarbus interpretuojant naujausias nepriklausomas gatavų vakcinų buteliukų analizes.
mokslininkai3 ir reguliuotojai4 pranešė, kad beveik kiekviename tirtame buteliuke buvo aptikta DNR teršalų. Šie teršalai apėmė ir dvigrandžią DNR, ir RNR-DNR hibridus, kurie atrodė atsparūs DNazės I virškinimui.
Kai kuriuose mėginiuose DNR, koduojančios spyglius, buvo daugiau nei 100 kartų didesnė nei kitose plazmidėse.5, rodantys netolygų arba nevisišką virškinimą. Sekvenavimo ir kiekybinės PGR analizės papildomai aptiko DNR fragmentus, kurių vidutinis ilgis buvo ~200 bazių porų, o kai kurie jų viršijo 4 kilobazes. Keliais atvejais buvo pastebėtos sekos, apimančios beveik visą plazmidę.
Apibendrinus šiuos duomenis, kyla rimtų klausimų dėl gryninimo nuoseklumo ir išsamumo didelio masto gamybos metu, taip pat dėl galimų biologinių pasekmių, kurias žmonėms gali sukelti likusios nukleorūgštys.
Kodėl nukleorūgščių teršalai yra biologiškai svarbūs
RNR ir DNR yra stiprūs įgimtų imuninių takų aktyvatoriai. Tai nėra spekuliacija. Šablonų atpažinimo receptoriai ir cGAS-STING kelias stipriai reaguoja į svetimas nukleorūgštis, sukeldami uždegimą, augimo slopinimą ir net ląstelių mirtį.
Būtent dėl šių mechanizmų genų terapijos produktams taikoma griežta saugos priežiūra.
Ironiška, bet COVID-19 mRNR vakcinos buvo sukurtos su modifikacijomis, specialiai tam, kad sumažintų šį stiprų įgimtą imuninį aktyvavimą. Tačiau RNR-DNR hibridai ir DNR fragmentai vis tiek sukels stiprų imuninį atsaką nepaisant šių modifikacijų.
Atkaklumas kelia naujų klausimų
Dabar yra daug įrodymų, rodančių, kad smaigalio mRNR ir baltymas žmogaus audiniuose išlieka savaites, mėnesius ir net metus po vakcinacijos (1 lentelė).
Kol kas nežinome, ar šis išlikimas atspindi ilgalaikį mRNR stabilumą, nuolatinę transliaciją ar DNR pagrindu veikiančius mechanizmus. Tačiau atsižvelgiant į DNR integracijos tikėtinumą ir ilgai išliekančią neintegruotą plazmidinę DNR raumenų ląstelėse,6 Nebūtų neprotinga manyti, kad „Spike“ mRNR, baltymo ir antikūnų prieš „Spike“ išlikimas praėjus keleriems metams po vakcinacijos nėra nesusijęs su DNR priemaišomis ir šalutiniais produktais po IVT.
1 lentelė. Dyglio mRNR ir baltymo išlikimas po vakcinacijos žmonėms
Trumpalaikės ir ilgalaikės saugos pasekmės
Apibendrinus šiuos duomenis, kyla keletas svarbių saugumo klausimų.
Pirma, buvo pranešta apie ūmias imunines reakcijas, įskaitant citokinų audras ir anafilaksiją, iškart po vakcinacijos. Tokių stiprių uždegiminių reakcijų nereikėtų visiškai atmesti kaip nesusijusių su priemaišomis, ypač atsižvelgiant į tai, kas žinoma apie nukleorūgščių sukeltą imuninę aktyvaciją.
Antra, ir dar svarbiau, yra ilgalaikė rizika. Nuolatinė spyglių raiška gali prisidėti prie lėtinių imuninių sindromų. Dar labiau nerimą kelia DNR integracijos galimybė, kuri kelia įterpimo mutagenezės arba genų sutrikimo riziką. Tai reiškia vėžio ar vystymosi defektų riziką, priklausomai nuo to, kur ir kokiame amžiuje DNR buvo integruota.
Pažymėtina, kad pati FDA savo informaciniuose lapeliuose teigia, jog šios vakcinos nebuvo... nebuvo įvertintas dėl kancerogeniškumo (vėžio formavimosi) arba genotoksiškumo (DNR pažeidimo) – tai būtų įprastas ir tikėtinas genų terapijos priežiūros aspektas, kai ilgalaikis stebėjimas yra standartinis.
DNR mRNR vakcinose reguliavimo spraga
Kadangi iš tikrųjų nebėra jokių ginčų dėl likusios DNR buvimo mRNR vakcinose, kyla klausimas, ar dabartinės gairės ir saugos ribos yra tinkamos mRNR vakcinoms. Esame užtikrinti, kad DNR šalutiniai produktai neviršija norminių teisės aktų nustatytų ribų. Taigi, kokios yra FDA rekomendacijos dėl DNR šalutinių produktų ir teršalų?
Dažniausiai cituojamos FDA rekomendacijos dėl liekamosios DNR (≤10 ng vienai dozei) buvo parengtos virusinėms vakcinoms, pagamintoms gyvose ląstelėse, kurios yra fragmentuotos ir „nuogos“, o jų gebėjimas patekti į žmogaus ląsteles yra ribotas. Tačiau mRNR vakcinos nėra gaminamos ląstelėse, jų liekamoji DNR nėra gauta iš šeimininko ląstelių ir, svarbiausia, mRNR vakcinų DNR nėra nuoga. Jos susijusios su LNP tiekimo sistemomis, kurios ypač palengvina DNR patekimą į ląsteles. 2010 m. FDA rekomendacijose aiškiai nurodoma, kad jose nenustatyta atitinkama saugumo riba DNR, susijusiai su LNP pagrindu pagamintais produktais.
Kitos dažnai cituojamos rekomendacijos yra PSO dėl rekombinantinių baltymų terapijos, skirtos likusiai DNR produktams, tokiems kaip monokloniniai antikūnai arba hormonai, pagaminti inžinerijos būdu gautose ląstelėse. Čia vėlgi likusi DNR yra kilusi iš šeimininko ląstelių arba raiškos plazmidžių, yra kaip pėdsakai, neinkapsuliuota DNR (plika), o galutinis produktas yra išgrynintas baltymas, o ne nukleino rūgščių pagrindu sukurta terapija (mRNR vakcina). Taigi šios rekomendacijos netaikomos mRNR vakcinoms.
Nei FDA, nei PSO dažniausiai cituojami likutinės DNR reguliavimo standartai nebuvo sukurtos mRNR vakcinoms ir tiesiogiai nesprendžia šios saugumo problemos.
Ką PSO pasakė apie mRNR vakcinas – po dislokavimo
2022 m. Pasaulio sveikatos organizacija išleido konkrečias mRNR vakcinų rekomendacijas.7Pažymėtina, kad šis dokumentas buvo išleistas po šių produktų diegimą visame pasaulyje. Jame konkrečiai teigiama, kad šios gairės buvo parengtos reaguojant į: „su šia nauja technologija susiję saugos, gamybos ir reguliavimo klausimai.Dokumente taip pat yra keletas svarbių teiginių:
"Kadangi dar nėra išsamios informacijos apie gamybos metodus, kontrolė dar nėra standartizuota saugioms ir veiksmingoms mRNR vakcinoms, o tam tikra informacija lieka nuosavybės teise saugoma ir todėl nėra viešai prieinama, šiuo metu neįmanoma parengti konkrečių tarptautinių gairių ar rekomendacijų."
Jame taip pat teigiama: „Išsamios gamybos ir kontrolės procedūros... turėtų būti aptartos su NRA [Nacionaline reguliavimo institucija] ir jos patvirtintos.] kiekvienu atveju individualiai."
PSO pripažįsta, kad mRNR vakcinų kontrolė dar nebuvo standartizuota ir kad nebuvo įmanoma nustatyti konkrečių tarptautinių gairių ar rekomendacijų. Be to, nacionalinėms institucijoms atliekant kiekvieno atvejo vertinimą reikalinga reguliavimo priežiūra.
Tai buvo pareikšta po to, kai buvo panaudotos mRNR vakcinos..
Šio „Substack“ rašymo metu FDA vis dar nebuvo nustačiusi standartizuotų mRNR vakcinų gairių ir nepateikė jokių įrodymų bei saugumu pagrįstų duomenų, patvirtinančių bet kokius DNR apribojimus mRNR vakcinose.
Galiausiai, verta pakartoti: nors mRNR technologija nėra nauja, iki Covid ji buvo reguliuojama kaip genų terapija, o ne kaip tradicinė vakcina. Saugumo problemos, susijusios su Covid vakcinų DNR šalutiniais produktais, bus tokios pačios ir su bet kuria mRNR vakcina, įskaitant gripo, RSV ar net vėžio mRNR vakcinas.
Taip yra todėl, kad mRNR produktai iš esmės skiriasi. Jie turi patekti į ląsteles ir nurodyti joms gaminti svetimą baltymą. Tai nepanašu į jokias kitas įprastas vakcinas, kurios tiesiogiai tiekia baltymą. Ši platforma neturi klinikinio precedento, kaip ir nėra klinikinio precedento pakartotiniam dozavimui. Ir tikrai nėra precedento populiacijos mastu.
Šiame etape, kai nėra pandemijos, kaupiami mechanistiniai duomenys ir klinikiniai stebėjimai, o rinkoje gausu mRNR vakcinų produktų, mums reikia skaidrumo ir tiesioginio reguliavimo institucijų, ypač FDA, kuriančios svarbiausias šių produktų gamybos gaires, įsitraukimo į rimtus saugumo tyrimus, ypač kai tai susiję su DNR šalutiniais produktais.
Naujos technologijos reikalauja naujoviško tikrinimo – ne tylėjimo, provokavimo ar cenzūros.
Nuorodos
1 https://www.frontiersin.org/journals/molecular-biosciences/articles/10.3389/fmolb.2024.1426129/full
2 Webb C, Ip S ir kt. Mol Pharm. 2022 balandžio 4 d.; 19 (4): 1047–1058. doi: 10.1021/
3 https://www.tandfonline.com/doi/10.1080/08916934.2025.2551517?url_ver=Z39.88-2003&rfr_id=ori:rid:crossref.org&rfr_dat=cr_pub%20%200pubmed
4 https://www.tga.gov.au/resources/publication/tga-laboratory-testing-reports/summary-report-residual-dna-and-endotoxin-covid-19-mrna-vaccines-conducted-tga-laboratories.
5 https://zenodo.org/records/17832183; https://www.scstatehouse.gov/CommitteeInfo/SenateMedicalAffairsCommittee/PandemicPreparedness/Phillip-Buckhaults-SC-Senate-09122023-final.pdf
6 Wang ir kt. (2004) – „Plazmidinės DNR integracijos į šeimininko genominę DNR aptikimas po intramuskulinės injekcijos ir elektroporacijos“ (Gene Therapy, 2004). Pelėms į raumenis buvo suleista plika plazmidinė DNR, po to atlikta elektroporacija, siekiant padidinti įsisavinimą. Naudodami labai jautrią PGR su išgryninta genomine DNR (su gelio atskyrimu, siekiant pašalinti ekstrachromosomines formas), autoriai nustatė keturis nepriklausomus integracijos įvykius praėjus 4 savaitėms po injekcijos. Jungčių sekoskaita patvirtino atsitiktines integracijos vietas (nėra pirmeninių karštųjų taškų), atitinkančias nehomologinį galų sujungimą. Integracijos dažnis buvo mažas, bet išmatuojamas. Tai vienas aiškiausių faktinių spontaniškų integracijos įvykių in vivo demonstracijų plika plazmidine DNR raumenyse. Pažymėtina, kad šiame tyrime buvo naudojamas sustiprintas DNR tiekimas elektroporacijos būdu, kurį galima palyginti su sustiprintu tiekimu per LNP.
Martin ir kt. (1999) – „Plazmidinės DNR vakcina nuo maliarijos: genominės integracijos potencialas po intramuskulinės injekcijos“ (Žmogaus genų terapija). Šiame ankstesniame tyrime buvo tiriama plazmidinės DNR intramuskulinė injekcija pelėse ir buvo naudojama Southern blot hibridizacija bei PGR su didelės molekulinės masės genomine DNR, siekiant nustatyti integraciją. Nors išlikimas dažniausiai buvo ekstrachromosominis, jie pateikė įrodymų, rodančių retą integraciją kai kuriuose mėginiuose (nors sekvenavimas nebuvo toks galutinai nustatytas kaip vėlesniuose darbuose). Tai nustatė mažos rizikos etaloną, tačiau pripažino labai mažai dažnių reiškinių potencialą, kuris turėjo įtakos vėlesnėms FDA rekomendacijoms dėl DNR vakcinų.
Ledwith ir kt. (2000) – „Plazmidinės DNR vakcinos: integracijos į šeimininko ląstelės DNR tyrimas po injekcijos į raumenis pelėms“ (Intervirology). Pelėms į raumenis suleidus plika plazmidinės DNR, buvo pastebėta integracija, ir nors aptinkamos integracijos nepastebėta, DNR vis tiek buvo aptinkama keturgalvio šlaunies raumenyje iki 26 savaičių. DNR buvo nechromosominė.
7 PSO Biologinės standartizacijos ekspertų komiteto 74-oji ataskaita, 3 priedas. Informacinės RNR vakcinų, skirtų infekcinių ligų prevencijai, kokybės, saugumo ir veiksmingumo vertinimas: reguliavimo aspektai https://cdn.who.int/media/docs/default-source/biologicals/vaccine-standardization/annex-3—mrna-vaccines_who_trs_1039_web-2.pdf
-
Dr. Charlotte Kuperwasser yra žymi Tuftso universiteto Medicinos mokyklos Vystymosi, molekulinės ir cheminės biologijos katedros profesorė ir Tuftso universiteto konvergencijos laboratorijos direktorė. Dr. Kuperwasser yra tarptautiniu mastu pripažinta dėl savo patirties pieno liaukų biologijos, krūties vėžio ir prevencijos srityse. Ji yra Imunizacijos praktikos patariamojo komiteto narė.
Žiūrėti visus pranešimus
